湖南一号方通过作用于ACE2防治新型冠状病毒肺炎的网络药理学研究

2020年2月11日世界卫生组织正式将2019年底爆发的由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发的肺炎命名为新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）。截至2020年5月7日，世界确诊病例3,839,007例，死亡病例265,555例。新型冠状病毒感染患者在临床上可分为轻型、普通型、重型和危重型，主要临床表现为发热、干咳、呼吸困难等，严重者还会出现急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和出凝血功能障碍等危及生命的症状。该病毒传染性强、传播迅速且人群易感性强。然而，临床目前尚无特效治疗药物。因此，预防新型冠状病毒感染尤为重要。作为中华文明的瑰宝，中医药在这次疫情中发挥了重要作用。国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中，中医药治疗成为抗疫的重要组成部分[1]。
湖南省组织多位国医大师和专家经过反复分析论证，拟定了复工防疫中药预防处方（简称湖南一号方），由湖南省中医药管理局正式公布推广。药方由8味中药组成，包括黄芪15 g，白术9 g，防风6 g，藿香6 g，石菖蒲6 g，连翘9 g，山银花9 g，甘草6 g。主要用于成年人预防使用。研究表明血管紧张素转化酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）是SARS-CoV-2感染人体，进入细胞的重要靶点。SARS-CoV-2通过表面的S-蛋白与人上皮细胞的ACE2结合，侵入细胞后利用细胞内的物质进行复制繁衍[2]，研究提示通过靶向作用于ACE2，干扰其与SARS-CoV-2的结合能够有效地防止病毒的感染。因此，筛选和研发靶向ACE2的药物，降低ACE2在肺上皮细胞中的转录水平，抑制ACE2与SARS-CoV-2的结合率，对于防治COVID-19具有重要的临床价值。
网络药理学是在系统生物学理论和网络分析统计的基础上，对特定的生物系统进行网络分析，通过特定信号节点（Nodes）的选择以及信号通路的对比来进行多靶点药物分子设计的新兴学科。本研究基于系统生物学理论，通过收集湖南一号方中的活性成分，结合药物靶点数据库收集COVID-19、肺炎和ACE2表达密切相关的靶点，构建中药-活性成分-靶点-疾病网络，预测湖南一号方的活性成分与COVID-19、肺炎和ACE2表达密切相关的靶点之间的关系，探究湖南一号方多成分、多靶点、多途径防治COVID-19的作用机制，为湖南一号方临床防治COVID-19提供理论基础。
材 料

活性成分数据库：TCMSP（http://lsp.nwu.edu. /tcmsp.php）；有效成分结构数据库：PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；有效成分靶点预测数据库：Swiss Target Prediction（http://.swisstargetprediction.ch/）；PharmMapper（http://.lilab-ecust./pharmmapper/）；疾病靶点数据库：NCBI Gene（https://.ncbi.nlm.nih.gov/）；DisGeNet（https://.disgenet.org）；OMIM（https://omim.org/）；Drug Bank database（https://.drugbank.ca）；GeneCards（https://.genecards.org/）；TTD（http://db.idrblab.net/ttd）；蛋白相互作用数据库：STRING（https://STRING-db.org）；GO和KEGG分析数据库：DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；气泡图绘制平台：Omicshare（https://.omicshare./tools/）；图像绘制软件：Cytoscape3.7.2。

方 法

1湖南一号方活性成分筛选
通过TCMSP数据库分别以黄芪、白术、防风、藿香、石菖蒲、连翘、山银花、甘草为关键词检索湖南一号方中所有药物的活性成分。根据人体对药物吸收、分布、代谢及毒性的药代动力学ADMT参数，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且化合物类药性（drug likeness，DL）≥0.18为筛选条件[3-4]，对检索到的化学成分进行筛选，获得湖南一号方活性较高的有效成分。2湖南一号方活性成分靶点和疾病靶点的预测
通过PubChem数据库收集各有效活性成分2D和3D结构，再将有效活性成分结构导入Swiss Target Prediction和PharmMapper数据库中进行有效活性成分相关靶点的预测；通过NCBI Gene、DisGeNet、OMIM、Drug Bank database、GeneCards、TTD等数据库获取COVID-19、肺炎和ACE2表达密切相关的人类基因，得到疾病靶点。将活性成分与疾病靶点相互映射，获得活性成分-疾病共有靶点。3湖南一号方活性成分-疾病靶点相互作用网络构建
STRING是一个可在线分析蛋白质与蛋白质直接或间接相互作用关系的数据库。将湖南一号方活性成分-疾病靶点导入STRING，限定物种为“Homo sapiens”，得到活性成分-疾病靶点蛋白质相互作用网络。将导出的蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）相关信息导入Cytoscape3.7.2软件，并利用Network analyzer计算Degree值，通过网络图使PPI相关信息可视化。获得湖南一号方防治COVID-19的关键靶点。4湖南一号方中药-活性成分-靶点-疾病网络构建
依据活性成分-疾病靶点以及PPI网络中的相关数据，利用Cytoscape3.7.2构建中药-活性成分-靶点-疾病网络模型，并利用Network Analyzer对构建的网络进行分析，得到度（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality）等参数。5湖南一号方防治COVID-19 GO功能富集分析
基因本体论（Gene Ontology，GO）的分析主要包括生物学过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）3个方面，通过GO分析可明确湖南一号方防治COVID-19在细胞内发生反应的位置、涉及的分子功能和生物学过程。将PPI网络中的靶点导入DAVID数据库对湖南一号方防治COVID-19进行GO富集分析。6湖南一号方防治COVID-19 KEGG通路富集分析
将PPI网络中的靶点导入DAVID数据库对湖南一号方防治COVID-19进行KEGG通路富集分析，并将分析结果根据P值的升序绘制气泡图，旨在从信号通路层面探究湖南一号方防治COVID-19的分子机制。

结 果

1湖南一号方活性成分筛选及靶点预测
通过TCMSP数据库获取湖南一号方中的所有成分，其中黄芪87种、白术55种、防风173种、藿香94种、石菖蒲105种、连翘150种、山银花236种、甘草280种。根据OB≥30%且DL≥0.18进行筛选，最终获取湖南一号方中所含活性成分，其中黄芪20种、白术7种、防风18种、藿香11种、石菖蒲4种、连翘23种、山银花23种、甘草92种，共计198个活性成分。其中有10种成分为几种中药的共有成分。将每种中药中OB、DL值排名靠前的部分化合物和几种中药的共有成分列出，信息见表1。根据活性成分进行靶点预测，其中黄芪362个、白术19个、防风155个、藿香199个、石菖蒲78个、连翘407个、山银花323个、甘草1042个。删除冗杂和无靶点活性成分，湖南一号方中120个活性成分共对应靶点235个。

2COVID-19相关靶点的筛选
NCBI Gene、DisGeNet、OMIM、Drug Bank database、GeneCards、TTD等数据库获取COVID-19、肺炎和ACE2表达密切相关的靶点，其中COVID-19为11个，肺炎为232个，ACE2表达密切相关靶点为5556个。删除冗杂，得到疾病相关基因5715个。再经UniProt数据库进行转化。3湖南一号方活性成分-疾病靶点的预测
将湖南一号方中活性成分相关靶点与疾病相关靶点相互映射，即得到湖南一号方活性成分-疾病靶点，共有靶点90个。（见图1）湖南一号方活性成分-疾病靶点信息见表2。

图1 湖南一号方活性成分对应靶点与疾病靶点韦恩图

4湖南一号方活性成分-疾病靶点的蛋白相互作用网络
湖南一号方中120个活性成分所对应的235个靶基因中，通过与COVID-19相关的5715个靶基因相互映射得到90个共有基因，并将这些共有基因导入STRING数据库，对靶点蛋白构建PPI网络，进行靶点的相互作用关系研究，寻找核心靶点。（见图2）设置最低要求交互分数0.400，结果显示共有90个靶蛋白相互作用，其中相互作用的连接边有1048条，平均局部聚类系数0.673，平均节点度23.3，中间的方形为该PPI网络的核心基因。将该PPI网络导入Cytoscape，颜色深浅和形状大小与该基因在网络中的作用强弱呈正比。（见图3）通过对该PPI网络进行分析得到30个核心基因。表明ALB、IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK3和MMP9等基因为湖南一号方中活性成分与COVID-19相关的核心基因。（见图4）

图2 湖南一号方活性成分-疾病靶点的相互作用网络

图3 湖南一号方活性成分-疾病靶点的相互作用网络可视化

图4 湖南一号方活性成分-疾病靶点相互作用网络的核心基因

5湖南一号方单味中药-活性成分-靶点-疾病网络构建
采用Cytoscape软件中的网络分析功能进行分析。该网络中共有210个节点（120个活性成分节点和90个靶点节点）和1360条边，其中红色为活性成分-疾病靶点，周围为单味中药的活性成分，深蓝色为多味中药的共有成分。这充分体现了湖南一号方防治COVID-19多靶点、多成分的特点。（见图5）

图5 湖南一号方单味中药-活性成分-靶点-疾病网络

6湖南一号方活性成分-疾病靶点的GO功能富集分析
采用DAVID数据库进行GO功能富集分析。确定了1765个GO条目（P＜0.05）。生物过程（BP）相关条目有1627条，主要涉及氧化应激反应、活性氧代谢过程和对脂多糖的应答等；分子功能（MF）相关条目有97条，主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性和受体配体活性等；细胞组成（CC）相关条目有43条，主要涉及膜筏、膜微区和膜区等，提示湖南一号方防治COVID-19的作用与调节多种生物功能密切相关。（见图6）

图6 湖南一号方防治COVID-19涉及基因的GO富集分析

7湖南一号方活性成分-疾病靶点的KEGG通路富集分析
采用DAVID数据库对湖南一号方活性成分-疾病靶点进行KEGG通路富集分析，限定P＜0.05，获得85条富集结果。根据P值的大小排列，前20条KEGG代谢通路主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和PI3K-Akt信号通路等。其中排名前10的通路中涉及的相关基因，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路19个、HIF-1信号通路14个、IL-17信号通路13个、TNF信号通路13个、PI3K-Akt信号通路16个、VEGF信号通路7个、JAK-STAT信号通路10个、p53信号通路7个、NF-B信号通路8个和Toll样受体信号通路8个。提示湖南一号方防治COVID-19的作用与多条信号通路密切相关。（见图7）

图7 湖南一号方防治COVID-19涉及基因的KEGG富集分析

讨 论
在中国历史上的历次瘟疫中，中医药都发挥了巨大作用。随着COVID-19的爆发，全世界已有380多万人感染，26万多人死亡，2020年3月世界卫生组织总干事谭德塞宣布：根据评估，世界卫生组织认为当前新型冠状病毒肺炎疫情可被称为全球大流行。然而，目前却无任何特效药。据文献报道，COVID-19的潜伏期为1~14 d，大部分患者在3~7 d出现症状[5]。患者以发热、乏力、干咳为主要症状，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见，还会出现缺氧低氧等状态[6]。该病进展迅速，约半数患者多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为ARDS、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等[7]。该病的临床表现和传播发展符合中医学“疫病”或“温病”特点。外感疫疠之气，病位由表及里，多遵从卫气营血和上、中、下三焦传变规律[8-9]。湖南省多位国医大师和专家心系疫情，经过反复分析论证，拟定了湖南一号方对新型冠状病毒引起的肺炎进行防治。

湖南一号方8味药在配伍中的作用分别是：黄芪补脾肺之气，固表实卫，为君药；白术健脾益气固表，使气旺表实，腠理固密，为臣药；防风走表以祛风除湿，且升脾中清阳。而致肺气足；藿香、石菖蒲既解在表之风寒湿邪，又化在里之湿浊，且可辟秽和中；连翘、山银花既有辛凉透邪，清热解毒之效，又具芳香辟秽之功，共为佐药；甘草既可调和诸药，护胃安中，又可合黄芪、白术益气实卫固表，是为佐使。诸药配伍，固肺卫，实肌腠，健脾胃，化湿浊，辟秽气，解毒热。全方补中寓散，散不伤正，补不留邪；温中有清，温不助热，清不伤阳。共奏益气固卫、健脾和胃、辟秽化湿、清热解毒之功。
有文献报道，ACE2是SARS-CoV-2侵袭人体的关键受体，ACE2在动物体内也广泛存在，SARS-CoV-2可识别并结合动物体内的ACE2，并引起动物与人之间的传播[10-11]。SARS-CoV-2还可通过Spike蛋白的受体结合域与人体ACE2蛋白结合[12]。发表在《Nature》上最新的两项研究也揭示了SARS-CoV-2识别和结合人体ACE2的机制及形成复合物的晶体结构[13-14]。ACE2蛋白是SARS-CoV-2感染的关键受体，ACE2与SARS-CoV-2结合也是感染及传播的最主要途径。因此，基于ACE2为靶点筛选和研发药物对防治SARS-CoV-2感染非常必要。
本研究采用网络药理学构建湖南一号方中活性成分-疾病靶点的相互作用网络，结合生物信息学对湖南一号方的活性成分、靶点及机制进行探究。筛选并发现了湖南一号方中的活性成分，包括黄芪20种、白术7种、防风18种、藿香11种、石菖蒲4种、连翘23种、山银花23种、甘草92种，共计198个活性成分。通过删除冗杂和无靶点的活性成分，湖南一号方中120个活性成分共对应靶点235个。其中疾病靶点COVID-19为11个，肺炎为232个，ACE2表达密切相关靶点为5556个。本研究进一步发现湖南一号方防治新型冠状肺炎的靶点涉及ALB、IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK3、MMP9、CXCL8、EGF、EGFR、IL-1B、PTGS2、STAT3等。上述靶点大部分与AGE-RAGE、HIF-1、IL-17、TNF、PI3K-Akt、VEGF、JAK-STAT等信号通路密切相关。由于湖南一号方还涉及多条与病毒相关的信号通路，提示湖南一号方可能还对流感病毒等其他病毒感染有效。
HUANG C等[15]回顾性报道武汉市41例确诊COVID-19患者的临床情况中指出32%患者有合并症，其中20%患者合并糖尿病。可能由于糖尿病患者的免疫状态发生改变，导致其对病毒的易感性增加[16]。COVID-19的发病机制与SARS类似，可能是病毒与人呼吸道和肺组织的ACE2相结合后，发生一系列瀑布反应。已有研究证明，COVID-19导致的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）与糖尿病密切相关。ACE2在糖尿病中发挥着重要的抗炎和抗氧化作用，保护肺免于ARDS。SARS-CoV-2引起的严重肺损伤和ARDS易感性增加，可能由于糖基化使ACE2表达降低[17]。湖南一号方对糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路的调节作用可能使ACE2表达减少，对糖尿病合并COVID-19患者发挥较好的防治作用。此外，部分感染COVID-19患者还出现缺氧低氧的症状。有研究表明，缺氧低氧条件下HIF-1通路中的缺氧诱导因子1（HIF-1）能够促进人肺动脉平滑肌细胞表达的ACE2的转录水平持续上升，而湖南一号方则可能通过对HIF-1信号通路的调节减少ACE2的表达[18]，进而抑制SARS-CoV-2与ACE2的结合。另有研究表明，COVID-19患者的死亡与炎症风暴和氧化应激密切相关[19]，而ACE2的减少增加了还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）介导氧化应激[20]。富集分析显示，湖南一号方可通过调节PI3K-Akt通路相关的氧化应激与炎症风暴，下调ACE2的表达，抑制病毒与ACE2的结合。湖南一号方筛选的JAK-STAT信号通路还可介导非典型干扰素样反应，能够有效抑制戊型肝炎病毒等病毒在人体的复制[21]。JAK-STAT、TNF等其他信号通路也参与病毒感染后机体的炎症应答反应[22-23]。因此，湖南一号方可通过调节多条信号通路抑制ACE2的表达，对于SARS-CoV-2感染患者发挥一定的治疗作用，对于未感染者则起到良好的预防作用。
综上，本研究基于SARS-CoV-2结合的关键靶点ACE2，采用网络药理学对湖南一号方防治COVID-19的潜在作用及机制进行分析，发现湖南一号方通过多成分-多靶点-多途径发挥作用，提示其在防治COVID-19的临床价值。目前对SARS-CoV-2的研究仍在深入进行中，本研究旨在为COVID-19的中医药防治提供理论依据。

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引用本文献标准格式：
赵谭军，汪瑜翔，蒋永亮，杜可，廖端芳，戴爱国，覃丽.湖南一号方通过作用于ACE2防治新型冠状病毒肺炎的网络药理学研究[J].,2020,26(10):1-7.作者：赵谭军，汪瑜翔，蒋永亮，杜可，廖端芳，戴爱国，覃丽改编自：湖南一号方通过作用于ACE2防治新型冠状病毒肺炎的网络药理学研究文字编辑：刘颖

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